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为什么要从化学发光转换到荧光检测
点击次数:53 发布时间:2019-06-21

Western blot成像方法取决于二抗的标记物,常用的方法有基于酶促反应的化学发光法,基于荧光染料的可见荧光方法和红外荧光方法,那么我们应该如何选择呢?
*合适的Western blot实验方法取决于您期望获得哪些信息,也就是取决于您的实验目的,小编比较了现有方法的优缺点,并分享了自己的心得,希望能够帮助您选择到*佳的实验方法。

化学发光方法
化学发光western blot是相对容易且灵敏度极高的检测方法,灵敏度可以达到fg级。
适用于研究:通过电泳可轻松分离的分子量差异显著的蛋白。

> 检测单一蛋白
> 确定蛋白有无
> 检测抗体反应
> 蛋白纯度分析
> 检测低丰度蛋白
 

优势劣势
灵敏度高半定量
实验流程熟悉酶促反应
兼容胶片和数字成像系统一次只能检测单一信号
 需要玻璃和重孵育
 胶片没有过饱和提醒

 
荧光检测方法
荧光染料分为可见荧光染料和红外荧光染料,从而将荧光western blot检测分为可见荧光检测和红外荧光检测。目前可见荧光检测*多三个通道,可以同时检测三种不同的蛋白,近红外检测*多为两个通道,一定选择激光光源激发的哦,更接近近红外染料的*大发射波长680nm和800nm,增强二抗信号,提高检测的灵敏度。
荧光Western blot使用荧光染料标记的二抗进行检测,膜上的靶标蛋白浓度与可见荧光信号强度呈线性关系,实现真实可靠的定量分析。荧光染料发射光谱不同,因此在一张印迹膜上可实现多重检测。在无需剥离和重孵育条件下,进行上样量质控,可以分析翻译后修饰蛋白。
因此当您进行如下实验室,选择荧光检测方法,妥妥的:

> 同时检测多种蛋白
> 研究翻译后修饰蛋白
> 同一印迹膜的上样质控
> **定量western blot实验
 

优势劣势
可进行多重检测膜会有自发荧光
定量 
信号持久稳定 
实验方法不需改变太多 

 
期刊杂志要求:
例如nature中“Image Integrity and Standards”中鼓励在一张印迹膜上进行内参和目的蛋白的的检测,同时使用合理的标准化方法:例如:全蛋白归一化。


 
化学发光属于酶促反应,动态范围窄,只能实现定性分析,一次只能检测一个信号,如要检测多个信号,需要剥离和重孵育,如使用胶片成像,还需要反复摸索曝光时间,显影定影设备和设备的维护,荧光检测可同时满足期刊杂志发表要求、一次可进行多个信号检测,反应条件一致,jingzhun定量,特别近红外荧光检测方法,具有低背景,高信噪比,是现在western blot荧光定量的金标准。

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